双荧光素酶报告基因检测系统-promega 双荧光素酶报告基因检测原理

      Dual—Luciferase® Reporter Assay

      试剂准备

      Luciferase Assay Buffer II                      10ml

      Luciferase Assay Substrate                    1vial

      Stop ＆ Glo® Buffer                          10ml

      Stop ＆ Glo® Substrate， 50X                    200ul

      Passive Lysis Buffer （PLB)， 5X                30ml

      1.1X PLB： 加1体积的5X Passive Lysis Buffer （PLB)到4体积的dH20中，40C保存(一个月)。

      2.LAR II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II  中（—200C保存1个月,-700C保存1年)。

3.1X Stop ＆ Glo 试剂：1体积50X Stop ＆ Glo® Substrate加入49体积的Stop & Glo® Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul）

      细胞处理                                     

      1.吸除细胞培养液                     

      2.1X PBS轻柔的冲洗细胞

      3.加入1X PLB（推荐用量）

      4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min,瞬时转染和报告基因实验

      采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100,p—401/+100,p—238/+100，p-80/+100,p—25/+100。pGL3- basic为阴性对照；同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent）说明书进行。

      1。 将质粒DNA(3。2µg)与phRL-tk （0。8µg）按1：4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;

      2。 A+B混匀（B加入A）15s，室温下孵育5—10 min；

      3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0。8mL；

      4。 6h后，加入2mL完全DMEM;

      5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;

      6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO， Sigma);

        （H2O2不引起OGG1升高）

      7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪（30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作.

      8。 以相对荧光素酶单位(相当于对照组的百分比）表示.结果采用Student-t检验分析各组之间荧光素酶活性的差异。