双荧光素酶报告基因检测原理 双荧光素酶报告基因检测原理及方法

      双荧光素酶报告基因检测原理

      荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。

      双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。

通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

      通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。

      理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固 有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

      双荧光素酶报告基因检测原理：

      将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

      常用荧光素酶报告基因载体：

      1、pRL-TK这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体，含有SV40增强子，质粒图谱如下所示：2、pGL3-Basic是萤火虫荧光报告载体，图谱如下图所示：

      从这两个图谱中可以发现，ppGL3-Basic这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。

      3、pmir-GLO将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，偏差更小且单质粒转染比双质粒共转染更简单。该质粒也是由promega公司开发的，图谱如下所示：实验基本流程：

      1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因Luc/Rluc的重组质粒；2、共转染: 将带有Luc/Rluc标记的报告基因和目的基因进行共转染，通常24-48h；（选择转染效率较高的HEK-293T细胞或原代细胞等）

      3、细胞处理: 双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；

      4、荧光检测: 使用酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测

      5、数据分析实验案例：

      CDK9是miR-206的靶标(a)，但是CDK9突变型不是miR-206的靶标(b)。通过构建出荧光素酶报告载体，将荧光素酶与CDK9基因连接(b)，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-206 inhibitor显著的提高了WT-CDK9的相对荧光素酶活性，但是对MUT-CDK9没有明显的影响(c)。qPCR测量了CDK9在不同细胞内的表达水平，经过miR-206 inhibitor处理后，CDK9的mRNA表达水平均有明显上升(d)。以上结果说明，miR-206可以结合CDK9，对CDK9的表达水平进行调控，进而影响细胞周期。