荧光素酶报告基因检测影响因素及注意事项 荧光素酶报告基因检测原理

      荧光素酶报告基因检测影响因素及注意事项

      1． 报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。

      2． 细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解

      3． 双荧光素酶报告基因的载体选择：

      a) 萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；

      b) 海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启

动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）

      4． 双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

      5． 最适反应温度：室温（20-22℃）。各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

      6． 双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差

      7． 细胞裂解液无需离心去沉淀。

      8． 被动裂解液存放：5×的裂解液，-20℃存放；1×裂解液，建议现用现配，4℃不能超过1个月

      9． 配好的工作液存放：萤火虫检测工作液，-20℃一个月；-80℃一年；海肾检测工作液，建议现用现配，-20℃不能超过15天，反复冻融6次活性损失≤15%

      10． 细胞裂解产物存放：常温6小时；4℃16小时，-20℃一个月；-80℃半年或更长

      11． 裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致12． 检测结果：Modulus单管型检测仪的检测范围0-2千万，Modulsu微孔板检测仪的检测范围0-2亿。但实验结果最好落在在“千-百万”这个范围中，这时受实验背景影响最小，线形最好。

      a) 空管检测仪器背景约100左右，样品检测结果最好能比样品高出一个数量级，即检测值上千。

      b) 检测值过小（比如300）：说明样品中荧光素酶表达过低，可能与细胞状态、转染条件、转染量、载体结构、启动子活性等有关，如果条件允许，调整各个影响因素，提高发光值。

      c) 检测值过高（比如1千万）：说明样品中荧光素酶表达过高，可能会接近或超过仪器检测上限，建议通过降低转染量或减少检测体积等降低发光。长期检测强光，对仪器有一定的损害。13． 半衰期：

      a) 单报告检测试剂盒（E1500）中，萤火虫荧光素酶发光半衰期约12min

      b) 双荧光素酶检测试剂盒（E1910）中，萤火虫荧光素酶发光半衰期约9min，海肾荧光素酶发光半衰期约2min